如何减少样本污染和降解对PGT-A检测准确性的影响?

在 PGT-A(植入前基因检测 - 非整倍体筛查)过程中，样本污染和降解是影响检测准确性的关键因素。以下从操作流程、技术优化、质量控制等方面，详细说明减少此类影响的方法：

一、样本采集环节的污染控制

1. 严格的操作环境管理

实验室洁净度要求：采集胚胎样本(如囊胚期的滋养外胚层细胞)需在 ISO 5 级以上洁净实验室中进行，配备层流净化工作台、空气过滤系统，定期消毒(如紫外照射、甲醛熏蒸)，避免灰尘、微生物等外源 DNA 污染。

操作人员规范：医护人员需穿戴无菌手术服、手套、口罩，操作前用 75% 酒精消毒手部及工具，避免皮肤接触样本(皮肤携带的细菌、人体 DNA 可能污染)。

2. 胚胎活检工具与耗材的无菌化

活检针与培养液的无菌处理：使用一次性无菌活检针，避免重复使用;胚胎培养液需经过支原体、细菌、真菌检测，且开封后在规定时间内使用(如 24 小时内)，防止微生物滋生。

耗材的无 DNA/RNA 酶处理：采样管、吸管等耗材需经过 DEPC 水处理或购买商品化无核酸酶产品，避免环境中核酸酶降解样本 DNA。

二、样本处理与运输中的防降解措施

1. 细胞裂解与核酸保护

快速裂解细胞：活检获取的少量胚胎细胞(通常 3-5 个)需立即放入含蛋白酶 K 和裂解缓冲液的专用管中，65℃温育 10-15 分钟，彻底裂解细胞并灭活核酸酶，防止 DNA 降解。

添加核酸酶遏制剂：裂解液中加入 RNase 遏制剂、EDTA(螯合金属离子，遏制核酸酶活性)，确保 DNA 在提取过程中保持完整。

2. 运输与保存的温度控制

冷链运输：样本若需外送检测，需用干冰(-78℃)或冰袋(4℃)保存，避免反复冻融(冻融过程会导致 DNA 断裂)。运输时间应控制在 24 小时内，确保样本活性。

短期保存规范：若样本暂时不检测，需储存在 - 80℃超低温冰箱，避免 - 20℃保存(该温度易导致冰晶形成，破坏 DNA 结构)。

三、检测流程中的污染防控技术

1. 核酸扩增前的污染预防

分区实验室操作：将样本处理、PCR 设置、产物分析分置于不同房间，避免气溶胶污染(如 PCR 产物扩散至样本制备区)。每个区域使用专用仪器(如移液器、离心机)，禁止交叉使用。

阴性对照设置：每次检测需加入空白对照(无模板 DNA)、试剂对照(仅含反应体系不含样本)，监测操作过程中是否存在污染(若对照出现阳性结果，需重新实验)。

2. 高效的 DNA 扩增技术

采用全基因组扩增（WGA）技术：针对微量胚胎细胞(DNA 量仅约 1-5ng)，使用多重置换扩增(MDA)或聚合酶链反应(PCR)等 WGA 方法，确保 DNA 均匀扩增，减少降解片段的影响。MDA 技术利用 φ29 DNA 聚合酶的高保真性和链置换活性，可扩增出长片段 DNA(>10kb)，降低降解导致的片段丢失。

优化扩增体系：添加 DNA 稳定剂(如牛血清白蛋白 BSA)、高保真聚合酶，减少扩增过程中的错配和非特异性产物，提高检测准确性。

四、质量控制与污染溯源

1. 样本质量评估

DNA 浓度与完整性检测：提取 DNA 后，用 Qubit 荧光定量仪检测浓度，确保≥1ng/μL;通过琼脂糖凝胶电泳观察 DNA 条带，若出现弥散状条带，提示样本降解，需重新活检或调整检测方案(如采用更耐受降解的短片段扩增技术)。

基因组覆盖度分析：在测序或芯片检测后，通过生物信息学分析基因组覆盖均匀性，若某区域覆盖率过低或存在大片段缺失，需排除降解或污染导致的假阴性结果。

2. 污染溯源与排除

STR（短串联重复序列）分型比对：将胚胎样本 DNA 与父母外周血 DNA 进行 STR 分型，若样本中出现非父母来源的 STR 位点，提示存在外源污染(如医护人员或其他样本的 DNA)，需重新检测。

生物信息学污染过滤：测序数据中若发现大量非人类基因组序列(如细菌、真菌 DNA)，可通过序列比对软件(如 BWA)过滤污染物，避免误判。

五、新技术与流程优化

1. 单细胞测序技术的应用

采用单细胞全基因组测序，减少因样本量少导致的降解风险，同时通过单细胞水平的数据分析，排除少量污染细胞对整体结果的影响(如某细胞因污染出现假阳性，可通过多细胞联合分析识别)。

2. 自动化操作平台

使用自动化核酸提取仪、PCR 工作站，减少人工操作误差和污染风险(如移液过程中的气溶胶产生)，同时通过程序设定严格控制反应温度和时间，优化扩增效率。

总结：多维度防控体系

减少样本污染和降解需从 “采集 - 处理 - 检测 - 分析” 全流程把控，通过环境无菌化、操作标准化、技术高效化及严格的质量控制，最大限度保障 PGT-A 检测的准确性。若出现样本质量问题，需及时与实验室沟通，评估是否需要重新活检或调整检测方案，避免因误差导致胚胎误判。